产品描述 

Product overview 基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端 补平等操作，依据 DNA 片段与线性化载体末端的 15~25 nt 同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性 载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的 DNA 定向克隆技术。 Hi-Efficienct Cloning Mix 为 2×重组 Mix，一次反应可完成单至多个 DNA 片段的重组， 仅需 5 分钟 即可完成单片段重组，且阳性率高于 95%。Cloning Mix 中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率，经优化的 反应体系，能够一定程度上耐受未纯化 PCR 产物中含有的杂质，在克隆阳性率与兼容性方面有着优异的表现。

运输与保存方法 Transportation and preservation methods

冰袋运输；-20℃保存，有效期 2 年；建议 次使用时分装冻存，避免反复冻融。

使用方法 Usage method

1. 克隆载体的线性化 

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向PCR扩增完成。

1）酶切制备 

      使用限制性内切酶进行载体线性化时，推荐使用双酶切方法进行，其次是单酶切。推荐使用快速内切酶， 使载体线性化完全，可以适当延长酶切时间减少环状质粒模板残留，以降低转化背景（假阳性克隆）。 

注 1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化； 

注 2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或将目的产物进行纯化后再用于重组反应。

 2）反向PCR扩增制备线性化载体：

       反向 PCR 扩增制备线性化载体时为了减少扩增突变的引入，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，推荐 使用预线性化的质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注：以环状质粒为模板时，PCR 产物需要使用 DpnI 等甲基化敏感型限制性内切酶对扩增产物进行处理，或对产物进行胶回 收纯化。

2. 目的片段的获取 

1）目的片段 PCR 引物设计 

       通常使用 PCR 扩增的方法来获得目的片段，PCR 引物的 5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体） 末端同源的 15~25 nt（推荐 18 nt）序列,以保证扩增产物的 5'端和 3'端分别与相邻片段形成重叠序列。目的片 段 PCR 引物包括：载体与插入片段连接处引物、插入片段与片段连接处引物。 所得线性载体的两端因线性方式（双酶切、单酶切、反向 PCR 扩增等）不同，分为三种末端结构的任意 组合，插入片段的特异性引物的设计仍然遵循通常引物设计的原则。

方案一：克隆载体使用单酶切或者双酶切 

方案二：克隆载体使用反向 PCR 扩增 

方案三：多片段引物设计方案

注 1：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游 25 nt 区域内 GC 含量为 40%~60%时， 重组效率 ； 

注 2：最终的 PCR 引物长度如果超过 40 nt，推荐在引物合成时选用 PAGE 纯化。

2）目的片段的 PCR 扩增 

推荐使用高保真 PCR Mix 进行插入片段的扩增，以减少突变的引入。

注：PCR 产物建议纯化后再进行重组反应；若 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可以直接使用，但加样 体积不应超过 2 μl（总反应体积的 20%）。 

实验流程