1、产品简介
BOLAZfast “一步法快速克隆试剂盒”可用于无缝克隆外源澳 DNA 片段：简单、快速、高效。该方法不依赖于任何限制性内切酶，可将任何外源澳 DNA 片段定向克隆至任意载体的任意位点（特殊情况，如有毒基因的克隆或插入外源DNA后导致质粒本身不稳定等除外）。因此，在基因克隆、DNA 拼接和澳DNA 定点突变等领域有广泛用途。
2、产品组成
组分 CSCE1101(50 rxn)
2 × BOLAZfast Single One-Step Cloning kit 500 μL
Control (1:1): 4-kb vector + 2.2-kb insert (50 ng/μL) 5 μL
注：阳性对照载体为 Amp 抗性。
3、产品保存
本产品应置于-20 °C 储存，并在使用时注意保持低温（如置于冰上）。
4、使用说明
4.1 制备线性化载体
在靶标载体上选择合适的克隆位点，对克隆载体进行线性化处理。如果可以选择的话，建议尽量选择无重复序列、无高级结构且 GC 含量在 40%~65%之间的区域用于外源 DNA 的克隆。常用的载体线性化方法包括：限制性内切酶酶切和设计反向引物进行 PCR 扩增制备。
4.2 酶切法制备线性化克隆载体
如果有合适的酶切位点，建议使用该方法，整个操作流程也比较简单。其中，双酶切比单酶切更好。酶切后，可以取少量酶切产物进行电泳，以确保全部载体被切开。对于绝大部分酶，可以对酶切产物进行 65° C 高温 20 min 灭活，然后直接用于后续无缝拼接反应，而无需对酶切的载体进行胶回收或过柱回收等处理。
4.3 设计反向引物进行 PCR 扩增制备
建议使用高保真 DNA 聚合酶进行载体的扩增（如博雷兹生物科技的 FastPfu 酶等）以降低 PCR 扩增过程中引入的突变率。本试剂盒与常规 PCR 的反应体系兼容；因此，如果 PCR 产物条带单一，则可直接用于后续的重组反应（注：线性化载体作为模板时无需去除；而环形载体需要去除。如
载体有甲基化，则可使用 DpnI 进行酶切去除）。反之，如果 PCR 扩增产物的纯度较低，则应将PCR 产物进行电泳后用胶回收进行纯化。
4.4 设计用于扩增外源 DNA 片段的引物
通过在引物的 5’端引入与线性化克隆载体末端一致的 DNA 序列，长度在 15-20 bp 之间。
4.5 进行重组反应
4.6 反应产物转化
上述反应液可以直接用于感受态转化（一般为大肠杆菌感受态）。热激法转化流程：将反应液加到 100-200 μL 感受态细胞中，混匀后于冰上放
置 30 min；42 °C 热激 90 秒，冰水浴孵育 2 min；加入 800 μL SOC 或 LB 培养基，于 37 °C 摇床孵育 45 min。取适量（10-100 μL）菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置于 37 °C 培养箱过夜培养。 平板上长出的克隆可以使用“菌落 PCR 的方法”进行快速鉴定（或者“质粒快速抽提的方法”）。针对阳性克隆，可根据实验需求 进行进一步的序列测定。
5、阳性对照
使用阳性对照，载体（4 kb）和 1 个外源 DNA 片段（2.2 kb）进行无缝拼接，长出的克隆利用菌落PCR 的方法进行验证，正确的目的条带大小应该为 2.2 kb 左右。从图 2 中可以看出，随机挑选的 20个克隆全部正确（100%阳性率）。随后对上述阳性克隆进行两端 DNA 测序；测序结果表明，阳性克隆的序列全部正确。
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