产品储存
－20℃ 保存，有效期 12 个月
制品说明
本产品是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组 DNA 污染的反转录系统。试剂盒采用分子进化技术多点突变的新一代反转录酶，大幅度提高了稳定性和反转录效率。本试剂盒为一管式反转录预混 Mix，5 × TRUE RT MasterMix II 中含有反转录第一链合所需的所有试剂（TRUEscript HˉRTase、RNase Inhibitor、Random primers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、Buffer）。 通常Real Time RT-PCR 等实验需要先用 DNase I 消化去除 RNA 中残留的基因组 DNA(gDNA) ，但是传统 DNase I 处理复杂并容易造成 RNA 的降解和损失。本试剂盒中使用了具有 DNA 分解活性的特殊 4 ×gDNA Eraser Mix 2 分钟消除 gDNA 残留，不需要 DNase 消化和后续繁琐步骤。
适用范围
第一链cDNA合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的检测。
产品特点
1. 新一代反转录酶大幅度提高了稳定性和反转录效率。
2. 采用gDNA Eraser仅需2分钟清除DNA残留，不需要DNase 消化和后续繁琐步骤。
3. 全预混的反转录Mix，只需加入RNA和水，15分钟简单快速完成反转录。
4. 同时2种Mix在-20℃不易冻结，减少了化冻和混匀时间，使用更简单。
5. 本产品针对qPCR进行特别优化oligo dT和N6随机引物配比，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的反转录效率，最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。
操作步骤 (以20 μl反应体系为例，也可以采用10μl反应体系)
1. 将模板RNA和5 × TRUE RT MasterMix II在冰上解冻；4 × gDNA Eraser Mix和RNase free H2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀，可简短离心以收集残留在管壁的液体到管底。
2. 在RNAse free管里面加入以下成分：(建议使用PCR管冰上配制)
Components Volume
Total RNA/mRNA ≤ 12 μl *
4 × gDNA Eraser Mix 4 μl (见注意事项 3)
RNase free H2O to 16 μl（补足到总体积 16 μl）
* Total RNA 建议不超过 2 μg，mRNA 不超过 200 ng (20μl 体系)
3. 移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2分钟（或者37℃孵育5分钟）。控温步骤均建议PCR仪器上进行。
4. 继续直接在同一管加入如下成份：
Components Volume
5 × TRUE RT MasterMix II 4 μl (见注意事项 3)
5. 移液器轻轻吹打混匀（总体积20 μl）
如使用mRNA模板是来源于真核细胞（如人、小鼠的组织细胞）含有Poly(A)尾结构，42℃孵育15-20min。
如使用mRNA模板是来源于原核细胞（细菌）或者病毒等不含Poly(A)尾结构，25℃孵育10 min，42℃孵育15-20min。
注意：如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可尝试将反应温度提高至50℃，有助于提高产量。
6. 85℃加热 5 sec 失活TRUEscript Hˉ RTase和gDNA Eraser。
7. 得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。RT-qPCR
取适量反转录cDNA产物（一般不超过qPCR反应体积的1/10）作为qPCR模板，按照厂家荧光定量PCR试剂说明书进行下一步荧光定量PCR。 如果表达基因含量丰富，可以根据实际适当稀释cDNA模板使用。
注意事项
1. 避免RNase污染。
2. 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
3. 4 × gDNA Eraser Mix 、5 × TRUE RT MasterMix II 非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。4 × gDNA Eraser Mix 和5 × TRUE RT MasterMixII内包含的酶均为过量，即使每次按照3.6 μl-3.8 μl使用，也不影响使用效果。
4. 可以不经过基因组去除步骤，直接用5 × TRUE RT MasterMix II进行反转录。
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