ReadiLink iFluor 647蛋白标记试剂盒 提供了一种以微观方式标记抗体的最便捷方法。该试剂盒仅需要两个简单的混合步骤而无需纯化步骤。 试剂盒中使用的iFluor 和mFluor 染料的琥珀酰亚胺酯（SE）显示出与蛋白质的脂族胺的良好反应性和选择性，并形成羧酰胺键，其与天然肽键相同且稳定。 iFluor 和mFluor-抗体缀合物可用于免疫荧光染色，荧光原位杂交，流式细胞术和其他生物学应用。 每个ReadiLink 抗体标记试剂盒都提供了进行两次偶联反应（2x50μg蛋白质）的所有必需成分。 每个试剂盒可用于标记50-100μg单克隆，多克隆抗体或其他蛋白质（> 10 kDa），只需两个简单的混合步骤。ReadiLink iFluor 647蛋白标记试剂盒是美国AAT Bioquest研发的产品。

标准操作规程（标记50μg蛋白质）

将所有组分加热并在打开前将样品瓶短暂离心，并在开始结合前立即准备所需的溶液。 以下SOP是标记抗HDAC IgG抗体的实例。

1.准备蛋白质溶液（溶液A）：

为了标记50g蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1mg / mL），将5L（总反应体积的10％）的反应缓冲液（组分B）与50L目标蛋白质溶液混合。

注1.如果您的蛋白质浓度不同，请相应调整蛋白质体积，使~50μg蛋白质可用于标记反应。

注2：为了标记100g蛋白质（假设目标蛋白质浓度为1mg / mL），将10μL（总反应体积的10％）反应缓冲液（组分B）与100μL目标蛋白质溶液混合。

注3：蛋白质应溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中;如果蛋白质溶解在甘氨酸缓冲液中，必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，10 kDa（来自Millipore的cat＃UFC501008）去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。

注4：不纯抗体、牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体不会被很好地标记。

注5：如果蛋白质浓度小于1 mg / mL，则结合效率显着降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为1-2 mg / mL。

2.运行结合反应：

2.1将蛋白质溶液（溶液A）加入一瓶标记染料（组分A）中，通过反复移液几次将其混合均匀，或将小瓶涡旋几秒钟。

注意：使用标记染料的两个小瓶（组分A）通过将100μg蛋白质分成2x50μg蛋白质并使每个50μg蛋白质与一小瓶标记染料反应来标记100μg蛋白质。 将两个小瓶合并用于下一步。

2.2将缀合反应混合物在室温下保持30-60分钟。

注意：如果需要，可以旋转或摇动缀合反应混合物更长的时间。

3.停止共轭反应：

3.1添加5 L（对于50μg蛋白质）或10L（对于100μg蛋白质），其为TQ染色猝灭缓冲液（组分C）的总反应体积的10％到缀合反应混合物中（来自步骤2.2），将它们混合 好。

3.2在室温下孵育10分钟。

3.3标记的蛋白质（抗体）现在可以使用了。

参考文献

Deep Sequencing Analysis of the Eha-Regulated Transcriptome of Edwardsiella tarda Following Acidification
Authors: D Gao, N Liu, Y Li, Y Zhang, G Liu
Journal: Metabolomics (Los Angel) (2017): 2153--0769

Suramin inhibits cullin-RING E3 ubiquitin ligases
Authors: Kenneth Wu, Robert A Chong, Qing Yu, Jin Bai, Donald E Spratt, Kevin Ching, Chan Lee, Haibin Miao, Inger Tappin, Jerard Hurwitz
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences (2016): E2011--E2018

Glycosaminoglycan mimicry by COAM reduces melanoma growth through chemokine induction and function
Authors: Helene Piccard, Nele Berghmans, Eva Korpos, Chris Dillen, Ilse Van Aelst, Sandra Li, Erik Martens, Sandra Liekens, Sam Noppen, Jo Van Damme
Journal: International Journal of Cancer (2012): E425--E436