SMCC Plus 是美国AAT Bioquest生产的荧光染料 ，SMCC是一种不可裂解且可透膜的交联剂，间隔臂为8.3?。它含有胺反应性琥珀酰亚胺酯（SE）和巯基反应性马来酰亚胺基团。NHS酯在pH 7-9下与伯胺反应形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺与pH6.5-7.5的巯基反应形成稳定的硫醚键。SMCC的SE组与载体蛋白上的赖氨酸残基反应，将它们转化为反应性马来酰亚胺。SMCC是一种广泛用于产生稳定的马来酰亚胺激活的载体蛋白的试剂，其可以自发地与巯基反应。或者，可将这些相对稳定的马来酰亚胺活化的中间体冻干并储存，以便随后与半抗原缀合。与SMCC和sulfo-SMCC相比，SMCC Plus具有更高的水溶性和交联效率。

样品实验方案

1.制备用于含胺蛋白质的缀合缓冲液，蛋白质-NH ₂（缓冲液A）：磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）或pH 7.2至8.0的其他无胺缓冲液可用于此目的。 注意：避免在缀合过程中含有伯胺（如Tris或甘氨酸）和巯基的缓冲液，因为它们会与预期的反应竞争。如有必要，将样品透析或脱盐至适当的缓冲液如PBS中。 

2.制备含巯基蛋白质的缀合缓冲液，蛋白质-SH（缓冲液B）：pH 6.5-7.5的无巯基缓冲液可用于此目的。 注意：避免在缀合过程中含有巯基的缓冲液，因为它们会与预期的反应竞争。如有必要，将样品透析或脱盐至适当的缓冲液如PBS中。 注意：添加1-5 mM EDTA有助于螯合二价金属，从而减少含巯基蛋白质中二硫化物的形成。 

3.准备脱盐柱以将修饰的蛋白质与过量的交联剂和反应副产物分离。 

4.在其共轭缓冲液A和B中制备含胺（蛋白质-NH ₂）和含巯基蛋白质（蛋白质-SH）溶液。 

5.制备蛋白质＃1-SMCC Plus 缀合物：将适量的SMCC Plus 添加到缓冲液A中的蛋白质＃1溶液中。蛋白质-NH ₂的浓度决定了所需的SMCC Plus 的摩尔比。所需的SMCC Plus 量建议如下，但最佳比例必须通过使用目标蛋白质进行实验确定：

5.1 蛋白质样品<1 mg / mL使用40-80倍摩尔过量。

5.2 1-4mg / mL的蛋白质样品使用20倍摩尔过量。

5.3 5-10mg / mL的蛋白质样品使用5至10倍摩尔过量。 

6.将上述反应混合物在室温下孵育30-60分钟或在4℃孵育2-4小时。 注意：为了在完成前停止缀合反应，加入含有还原半胱氨酸的缓冲液，其浓度比Protein-SH的巯基高几倍。 注意：可以通过电泳分离和随后的蛋白质染色来估计缀合效率。 

7.使用用共轭缓冲液A平衡的脱盐柱除去多余的SMCC Plus 。 

8.将含巯基的（Protein-SH）和脱盐的含胺蛋白（Protein-NH ₂）-SMCC Plus 缀合物以最终缀合物所需的摩尔比混合并混合，并与巯基和活化的相对数量一致存在于两种蛋白质上的胺。 注意：与马来酰亚胺部分反应的分子必须具有游离（还原的）巯基。对于蛋白质，在室温下使用5mM TCEP还原二硫键30分钟，然后通过合适的脱盐柱两次。请注意，蛋白质（例如抗体）可能会通过完全还原其二硫键而失活。可以用2-巯基乙胺·HCl（2-MEA）实现IgG中铰链区二硫键的选择性还原。可以使用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）或2-亚氨基硫杂环戊烷·HCl（Traut's Reagent）将巯基化合物添加到分子中，其改性伯胺。 

数据分析

参考文献

N-glycan targeted gene delivery to the dendritic cell SIGN receptor
Authors: Kevin Anderson, Christian Fernandez, Kevin G Rice
Journal: Bioconjugate chemistry (2010): 1479--1485