Amplite 硫醇定量试剂盒(荧光法)绿色荧光是美国AAT Bioquest生产的用于硫醇定量的试剂盒 ，在许多生物系统中，检测和定量游离的硫醇（例如游离半胱氨酸、谷胱甘肽和蛋白质中的半胱氨酸残基）是生物学流程和事件研究中一项非常必要的任务。检测生物样品中减少的（GSH）和氧化的谷胱甘肽是评估细胞和组织中氧化还原作用和解毒作用的重要指标，这与保护谷胱甘肽的抗氧化作用和游离的自由基所介导的细胞损伤也有密切的关系。目前可定量检测生物系统中硫醇的试剂和试剂盒很少，并且在为数不多的商业化硫醇检测试剂盒中存在灵敏度较低、操作较冗长等缺点。Amplite 硫醇荧光法定量分析试剂盒 *绿色荧光* 提供超强灵敏度的硫醇（无论是小分子还是蛋白质中的硫醇）定量检测方案。本试剂盒使用一种本身不具有荧光的染料，该染料与硫羟基反应后会产生强烈的绿色荧光。本试剂盒提供高灵敏度的，一步荧光测定法，该法能够检测低至100 ul 分析体积(10 nM浓度)中半胱氨酸或者GSH中1pmol的硫醇。这项检测方案快捷且稳定，可以方便的用于96或者384微孔板分析，并且容易进行自动化分析，其Ex（吸收最大峰）/Em（最大发射峰） = 490 nm/520 nm。

样品实验方案

简要概述

1.准备GSH工作溶液（50μL）
2.添加GSH标准品或测试样品（50μL）
3.在室温下孵育10至60分钟
4.监测Ex / Em = 490/525 nm处的荧光增加（截止= 515 nm）

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 GSH标准溶液（1 mM）：
将200μLddH2 O加入到GSH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol /μL）GSH标准溶液。

1.2 Thiolite Green原液（100X）：
将100μLDMSO（组分D）加入到Thiolite Green（组分A）的小瓶中以制备100X Thiolite Green原液。

2.标准溶液配制
将30μL的1mM（1nmol /μL）GSH标准溶液加入到970μL的测定缓冲液（组分B）中以产生30μM（30pmol /μL）GSH标准溶液。 取30μM（30 pmol /μL）GSH标准溶液，进行1：3连续稀释，得到用分析缓冲液（组分B）连续稀释的GSH标准品（SD7-SD1）。 注意：稀释的GSH标准溶液不稳定。 在4小时内使用。

3.工作溶液配制

将50μL100XThiolite Green原液加入5 mL分析缓冲液（组分B）中，充分混合，制成GSH工作溶液。 注意：这种GSH工作溶液足以容纳一个96孔板。 在室温下不稳定，应在2小时内及时使用。 避免暴露在光线下。 注意：或者，可以通过按比例添加含有分析缓冲液（组分B）的100X Thiolite Green原液来制备GSH工作溶液。

操作步骤

表1.实心黑色96孔微孔板中GSH标准品和测试样品的布局。 SD = GSH标准品（SD1  -  SD7,0.014至10μM）; BL =空白对照; TS =测试样品

表2.每个孔的试剂组成

1.根据表1和2中提供的布局制备GSH标准品（SD），空白对照品（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25μL试剂代替50μL。 注意：根据需要处理细胞或组织样本。

2.向GSH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入50μLGSH工作溶液，使总测定体积为100μL/孔。 对于384孔板，在每个孔中加入25μLGSH工作溶液，总体积为50μL/孔。

3.在室温下孵育反应10至60分钟，避光。

4.用荧光酶标仪在Ex / Em = 490 / 525nm（截止= 515nm）下监测荧光增加。

参考文献

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