Amplite 比色法β-半乳糖苷酶检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于β-半乳糖苷酶 的试剂盒，大肠杆菌β-半乳糖苷酶是464kD四聚体。每个单位的β-半乳糖苷酶由五个结构域组成，其中第三个是活性位点。它是细胞中必不可少的酶。这种酶的缺乏可导致半乳糖醛酸病或Morquio B综合征。在大肠杆菌中，β-半乳糖苷酶是由LacZ操纵子的活化产生的。 LacZ表达的检测已经成为每个细胞检测少至5个拷贝的β-半乳糖苷酶的常规方法。该试剂盒使用发色半乳糖苷酶底物，可以灵敏地区分LacZ +和LacZ-细胞。淡黄色底物在与半乳糖苷酶反应时产生强紫色产物。它可用于检测ELISA型测定系统中的半乳糖苷酶缀合物或用于监测细胞中LacZ基因的表达。 Amplite 比色β-半乳糖苷酶检测试剂盒配备了所有必需成分和优化的检测方案。它可用于筛选半乳糖苷酶抑制剂或诱导剂。

样品实验方案

简要概述

1.用LacZ基因制备稳定或瞬时转染的细胞
2.用测试化合物孵育细胞（样品）
3.裂解细胞
4.将裂解液转移至微量滴定板
5.添加β-Gal工作液
6.根据细胞类型，在室温或37°C孵育至少10分钟
7.添加停止反应试剂
8.监测Ex / Em = 540/590 nm的荧光强度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 β-半乳糖苷酶底物储备液（200X）：
将50 μL DMSO（组分E）添加到试卤灵β-半乳糖苷酶（组分A）的小瓶中，制成200Xβ-半乳糖苷酶底物原液。 注意：25 μLβ-半乳糖苷酶底物储备液足以容纳1个板，避光。

2.标准溶液

β-半乳糖苷酶标准品
可选（如果需要标准曲线）：用0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液制备一系列β-半乳糖苷酶（大肠杆菌）标准品的稀释液。 将标准曲线上每个点的等分试样50 μL转移至平板的对照孔中。 β-半乳糖苷酶的最高推荐量为200 mU / mL（200-400 ng）。建议按1：3的比例稀释由8个点组成的标准曲线。 注意：调整标准曲线以适合特定的实验条件，例如细胞类型，数量，转染效率和培养板的大小。 每次进行测定时，必须新鲜制备标准曲线的稀释液。

3.工作溶液

1.1 0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液：
将30 μLβ-巯基乙醇（组分F）添加到10 mL反应缓冲液（组分B）中，并充分混合。 注意：制备酶稀释缓冲液需要额外的缓冲液，用于生成标准曲线。

1.2 β-Gal工作液：
将25 μLβ-半乳糖苷酶底物储备液（200X）加入5 mL的0.3％β-巯基乙醇测定缓冲液中。 注意：β-Gal工作溶液足以用于一块96孔板。

1.3 裂解缓冲液工作液：
使用前，将5 μLβ-巯基乙醇（组分F）加入5 mL裂解缓冲液（组分D）中。 注意：在裂解细胞之前，始终将0.1％β-巯基乙醇添加到裂解缓冲液中。

样品操作及分析

表1.细胞培养板推荐的Lysis Buffer工作溶液体积

1.从哺乳动物细胞制备细胞提取物

1.1用测试化合物处理含有LacZ基因的细胞所需的时间。

1.2用1X PBS洗涤细胞两次。不要移动细胞。

1.3用Lysis Buffer工作溶液相应地裂解细胞。

1.3.1对于贴壁细胞：将Lysis Buffer工作溶液添加至培养板。有关建议的数量，请参见表1。

1.3.2对于非贴壁细胞：将细胞沉淀到离心管中，并向管中加入50-2000 μL Lysis Buffer工作溶液（取决于细胞沉淀的大小）。

1.4将上一步的细胞在室温下孵育10-15分钟，然后轻轻旋转平板或试管数次以确保完全裂解。

1.5继续进行β-半乳糖苷酶测定，或将样品在-80°C下冷冻直至使用。注意：通过快速的冻融循环（在-20°C到-80°C冷冻1-2小时，然后在室温解冻）也可以获得良好的裂解。或者，将细胞裂解液离心2-3分钟以沉淀不溶物，然后测定上清液。

2.运行?-半乳糖苷酶测定

2.1如果需要，在室温下解冻裂解细胞管或板。如果细胞接种在96孔板上，则直接在96孔板上进行测定。

2.2在96孔板的每个孔中加入50 μL细胞提取物。如果需要标准曲线，请为标准曲线保存一些对照孔（50 uL /孔）。注意：如有必要，当转染效率很高时，可在裂解缓冲液工作溶液中稀释裂解液，或在转染效率低时减少裂解液的体积。如果在96孔板上进行转染，或将稳定的细胞系接种到96孔板上，请直接在板上进行测定。对于内源性β-半乳糖苷酶活性控制，请添加50 μL非转染细胞的细胞裂解液。对于空白对照，添加50 μL Lysis Buffer工作溶液。

2.3向每个孔中加入50 μL的ResorufinβDG工作溶液。根据细胞类型，将板在室温或37°C下孵育大约10分钟至4小时。

2.4向每个孔中添加50 μL终止缓冲液（组分C）。

2.5使用吸光度酶标仪测量在580 nm至460 nm（Ab580 / Ab460）波长下的OD比，监测吸光度的增加。

参考文献

BZLF1 Attenuates Transmission of Inflammatory Paracrine Senescence in Epstein-Barr Virus-Infected Cells by Downregulating Tumor Necrosis Factor Alpha
Authors: Xubing Long, Yuqing Li, Mengtian Yang, Lu Huang, Weijie Gong, Ersheng Kuang
Journal: Journal of Virology (2016): 7880--7893