Caspase 8荧光底物Ac-IETD-AMC 蓝是美国AAT Bioquest生产的荧光底物 ，半胱氨酸蛋白酶在细胞凋亡或程序性细胞死亡中是必需的，在发育和成年生活的大多数其他阶段，并且因其在细胞中的作用而被称为“刽子手”蛋白质。免疫系统中也需要一些半胱天冬酶用于淋巴细胞的成熟。细胞凋亡失败是肿瘤发展和自身免疫疾病的主要原因之一。半胱天冬酶也参与缺血和阿尔茨海默病。凋亡caspase有两种类型：引发剂和效应剂。 启动子半胱天冬酶（例如，CASP2，CASP8，CASP9和CASP10）切割效应半胱天冬酶的无活性前体形式，从而激活它们。效应子半胱天冬酶（例如，CASP3，CASP6，CASP7）依次切割细胞内的其他蛋白质底物，以触发细胞凋亡过程。该级联反应的起始受半胱天冬酶抑制剂的调节。

AAT Bioquest提供一组蓝色，绿色和红色荧光底物，用于监测caspase活性。AMC-，AFC-，R110-和ProRed - 衍生的蛋白酶底物是无色和非荧光的。通过半胱天冬酶切割阻断蛋白酶可切割的肽残基分别产生强烈的蓝色，绿色或红色荧光，其可以通过荧光仪器监测。我们专有的ProRed 衍生的半胱氨酸蛋白酶底物是用于荧光检测各种半胱天冬酶活性的最敏感的红色指示剂。通常，R110和ProRed 底物比基于AMC-，AFC-或4-硝基苯胺的底物灵敏得多。

操作方法

以下说明书仅提供指南，实际应根据您的具体需求进行修改。

1.使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的一般溶液Caspase测定

1.1在DMSO中制备10mM储备溶液。

1.2制备2X半胱天冬酶底物（50μM）测定溶液，如下所示：

50 L基质原液

100L DTT（1M）

400L EDTA（100 mM）

10mL Tris缓冲液（20mM），pH = 7.4

1.3将等体积的半胱天冬酶标准品或样品与2X半胱天冬酶底物测定溶液（来自步骤1.2）混合，并在室温下孵育溶液至少1小时。

1.4使用荧光酶标仪检测荧光，或使用吸光度酶标仪检测吸光度。

2.细胞Caspase检测使用细胞渗透FMK半胱天冬酶探针

2.1在DMSO中制备2-5mM储备溶液。

2.2根据需要对细胞进行处理。

2.3通过用20mM Hepes缓冲液（HHBS）稀释Hanks中的DMSO储备溶液（来自步骤2.1），制备2X可渗透的半胱天冬酶底物（20μM）测定溶液。

2.4用2X半胱天冬酶底物测定溶液（来自步骤2.3）混合等体积的处理细胞，并将细胞在37℃，5％CO 2培养箱中孵育至少1小时。

2.5用HHBS洗涤细胞至少一次。

2.6用流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪监测荧光强度。

3.细胞Caspase检测使用细胞渗透性FMK Caspase探针（仅适用于＃13470-13476）

3.1通过向小瓶中加入50μLDMSO制备250X储备溶液。

3.2根据需要对细胞进行处理。

3.3将250 X DMSO储备溶液（来自步骤3.1）以1：250的比例（例如2 uL至500 uL细胞）添加到细胞溶液中，并将细胞在37°C，5％CO 2培养箱中孵育1 小时。

3.4用HHBS洗涤细胞至少一次。

3.5用流式细胞仪，荧光显微镜或荧光酶标仪监测荧光强度。

参考文献

pH-Assisted surface functionalization of selenium nanoparticles with curcumin to achieve enhanced cancer chemopreventive activity
Authors: Shaoxuan Yu, Yanru Wang, Wentao Zhang, Yuhuan Zhang, Wenxin Zhu, Yingnan Liu, Daohong Zhang, Jianlong Wang
Journal: RSC Advances (2016): 72213--72223