Amplite 荧光法组蛋白去乙酰化酶HDAC活性检测试剂盒 绿色荧光是美国AAT Bioquest生产的用于检测HDAC的试剂盒 ，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一类从组蛋白上的ε-N-乙酰基赖氨酸氨基酸中除去乙酰基的酶。去乙酰化恢复赖氨酸氨基酸的正电荷，这增加了组蛋白对DNA的带负电荷的磷酸骨架的亲和力。该过程通常通过阻断转录因子的进入来下调DNA转录。正在研究HDAC抑制剂作为癌症的治疗方法。

我们的Amplite 荧光HDAC活性检测试剂盒为检测HDAC活性提供了一种快速，方便，灵敏的方法。该试剂盒使用我们的非肽HDAC Green 底物，它比基于肽的HDAC底物（如Ac-RGK（Ac）-R110，Ac-RGK（Ac）-AMC和Ac-RGK（Ac） - 更敏感 - AFC。此外，HDAC Green 底物也比其他商业肽基HDAC底物更耐蛋白酶水解。我们的试剂盒可用于测量细胞裂解液中的HDAC活性或用细胞提取物或纯化酶筛选HDAC抑制剂。HDAC Green 底物的长波长发射使得该测定不受化合物和细胞组分的干扰。用490nm的激发和525nm的发射监测HDAC活性。

96孔板测定示例

概述

准备含有HDAC的样品（40μL）

添加HDAC抑制剂或测试化合物（10μL）

在室温或37℃孵育10-20分钟

添加HDAC Green 底物工作溶液（50μL）

在室温或37℃下孵育30-60分钟

监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前解冻所有试剂盒组分。

操作方法

1.准备工作解决方案：

1.1制备含有HDAC的测试样品：在测定缓冲液（组分B）中以1:40稀释5-10mg / mL HeLa核提取物或细胞裂解物。

注意：40μL稀释样品足以用于96孔板的一个孔。 使用前立即稀释提取物。 将溶液储存在冰上。

1.2制备HDAC抑制剂（Trichostain A）溶液的稀释液：在测定缓冲液（组分B）中以1：100稀释3mM曲古菌素A溶液（组分C），得到30μM曲古抑菌素A溶液。向每个抑制剂对照孔中加入10μL30μM曲古抑菌素A溶液。

1.3制备HDAC Green 底物工作溶液：将20μLHDACGreen 底物（组分A）和100μL信号增强剂（组分D）加入5 mL测定缓冲液（组分B）中。

注意1：稀释的HDAC Green 底物工作溶液不稳定，5 mL稀释的HDAC Green 底物工作溶液足以进行100次分析。

注意2：为每个实验准备新鲜的HDAC Green 底物工作溶液。 将重构的工作溶液保存在冰上直至使用。

2.运行HDAC分析：

2.1将40μL稀释的核提取物，酶溶液或其他HDAC样品和10μL测试化合物加入相应的微孔板孔中（参见说明书中的表1）。

对于阳性对照：用10μL测定缓冲液（组分B）加入40μL稀释的HDAC酶溶液或HeLa核提取物（来自步骤1.1）。

对于阴性对照：添加40μL稀释的HeLa核提取物（来自步骤1.1）和10μL30μM曲古抑菌素A溶液（来自步骤1.2），或使用不含HDAC活性的已知样品。

对于空白（无酶）：仅添加50μL测定缓冲液（组分B）。

2.2将板在室温或37℃下孵育10-20分钟。

注意：为了筛选HDAC抑制剂，在添加HDAC Green 底物工作溶液之前，先用HeLa核提取物或纯酶预孵育这些化合物（参见步骤2.3）

2.3将50μLHDACGreen 底物工作溶液（来自步骤1.3）加入每个孔中。 将板在室温或37℃孵育30-60分钟。

2.4 Ex / Em = 490 / 525nm时的监测荧光强度。

参考文献

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