Amplite 荧光法赖氨酰氧化酶（LOX）检测试剂盒 红色荧光是美国AAT Bioquest生产的用于检测赖氨酸氧化酶 的试剂盒。赖氨酰氧化酶是一种细胞外酶，其催化从胶原蛋白和弹性蛋白前体中的赖氨酸残基形成醛。 这些醛具有高反应性，并与其他赖氨酰氧化酶衍生的醛残基或未修饰的赖氨酸残基发生自发的化学反应。 化学反应导致胶原蛋白和弹性蛋白的交联，这对于稳定胶原纤维和成熟弹性蛋白的完整性和弹性是必需的。 生物样品中赖氨酰氧化酶的活性传统上通过使用放射性同位素标记的胶原蛋白或弹性蛋白底物的氚释放终点测定来评估。

Amplite 荧光Lysyl氧化酶检测试剂盒提供灵敏的荧光检测，用于检测赖氨酰氧化酶的活性。 它利用专有的LOX底物，在HRP偶联反应中使用我们的Amplite ADHP底物释放过氧化氢。 该方法允许检测亚ng / mL赖氨酰氧化酶，并且比目前可用的测定灵敏得多。 它消除了某些生物样品中发生的干扰，可以很容易地用于检测细胞提取物或溶液中的赖氨酰氧化酶活性。 其信号可通过Ex / Em = 540/590 nm的荧光酶标仪或~576 nm的吸光度酶标仪轻松读取。

96孔板测定示例

概述

准备测定反应混合物（50μL）

添加赖氨酰氧化酶标准品或测试样品（50μL）

在37℃孵育10-30分钟

在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻所有试剂盒组分。

操作方法

1.准备试剂：

注意1：在硫醇如DTT，谷胱甘肽（还原型：GSH）和β-巯基乙醇存在下，Amplite™HRP底物不稳定。浓度高于10μM的硫醇的存在将显着降低测定动态范围。

注意2：某些洗涤剂（如Brij-35，Tween-20和NP40），NADH和NADPH也会干扰检测。

1.1 250X Amplite™HRP底物储备液：将100μLDMSO（组分D）加入到Amplite™HRP底物（组分A）的小瓶中。应及时使用原液; 任何未使用的溶液应等分并在-20℃重新冷冻。

注意：避免反复冻融循环。

1.2 50U / mL辣根过氧化物酶储备溶液：将1mL测定缓冲液（组分B）加入到辣根过氧化物酶（组分C）的小瓶中。

注意：未使用的HRP溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备测定反应混合物：

根据说明书中的表格制备测定反应混合物并避光。

3.在上清液中进行赖氨酰氧化酶测定：

3.1将50μL测定反应混合物（来自步骤2）加入到赖氨酰氧化酶标准品，空白对照和测试样品（参见步骤2，表3）的每个孔中，以使总赖氨酰氧化酶测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL测定反应混合物。

3.2在37℃下孵育反应10至30分钟，避光。

3.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

4.对细胞进行赖氨酰氧化酶测定：

Amplite™荧光Lysyl氧化酶检测试剂盒可用于测量细胞中活性赖氨酰氧化酶的释放。 以下是建议的说明，可根据您的特定研究需求进行修改。

4.1在96孔板（50-100μL/孔）中制备细胞，并根据需要活化细胞。 

注意：包括阴性对照（单独培养基和非活化细胞）用于测量背景荧光。

4.2将50 μL赖氨酰氧化酶工作溶液添加到细胞培养基的每个孔中（来自上一步）和赖氨酰氧化酶标准品的孔中（参见表1）。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 μL工作溶液。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL细胞培养基和25μL测定反应混合物。

4.3在37℃下孵育反应10至30分钟，避光。

4.4使用荧光读板仪在Ex / Em = 530至570/590至600 nm（最大Ex / Em = 540/590 nm）下观察荧光增加。

参考文献

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