Cell Meter 荧光法细胞内过亚硝酸盐检测试剂盒 适用于流式细胞仪 是美国AAT Bioquest生产的用于检测亚硝酸盐 的试剂盒，过氧亚硝酸盐（ONOO-）是强氧化物质和高活性硝化剂。过氧亚硝酸盐由超氧化物自由基与细胞内产生的一氧化氮之间的反应形成。它可以破坏各种生物分子，包括蛋白质，酶，脂质和核酸，最终导致细胞死亡。同时，过氧亚硝酸盐还可以通过促进针对入侵病原体的宿主防御反应而在体内具有保护活性。因此，过氧亚硝酸盐是涉及广泛的生理和病理过程的必需生物氧化剂。由于其半衰期极短且稳态浓度低，因此检测和了解过氧亚硝酸盐在生物系统中的作用一直具有挑战性。为了解决这一未满足的需求，AAT Bioquest的Cell Meter 荧光细胞内过氧亚硝酸盐（ONOO-）检测试剂盒提供了一种监测活细胞中ONOO水平的灵敏工具。 AAT Bioquest的DAX-J2 PON Green是一种优秀的荧光探针，可与细胞间ONOO'发生特异反应，生成亮绿色荧光产品。该试剂盒针对流式细胞仪进行了优化。

样品实验方案 

简要概述

1.在生长培养基中准备细胞
2.将细胞与测试化合物（刺激ONOO′）和DAX-J2 PON Green工作溶液共同孵育
3.监测Ex / Em = 490/530 nm的荧光强度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 DAX-J2 PON绿色库存解决方案（400X）：
将25 μL DMSO（组分C）添加到DAX-J2 PON Green（组分A）小瓶中，并充分混合。 注意：1 μL的复配DAX-J2 PON Green储备液足以容纳0.4 mL的细胞。

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样品操作及实验分析

1.将DAX-J2 PON Green与测试化合物在完全培养基中或在所需缓冲液中的37°C下共孵育细胞一段时间，并避光。对于对照孔（未处理的细胞），添加相应量的化合物缓冲液。注意：建议用完全培养基染色细胞。但是，如果测试的化合物对血清敏感，则可以在染色前将生长培养基和血清因子吸掉。将细胞悬浮于1X Hank盐溶液和20 mM Hepes缓冲液（HHBS）或抽吸后选择的缓冲液中。或者，可以在无血清培养基中对细胞进行染色。我们将RAW 264.7巨噬细胞与50-200 μM SIN-1和DAX-J2 PON Green在完全培养基中于37°C共同孵育1小时，以诱导亚硝酸盐。有关详细信息，请参见图1（A）。

2.或者，用DAX-J2 PON Green在37°C避光的环境下染色细胞1小时。除去工作溶液，然后在完全培养基中或在所需的缓冲液中于37°C用测试化合物处理细胞所需的时间。有关详细信息，请参见图1（B）。

3.使用流式细胞仪监测FITC通道（Ex / Em = 490/530 nm）的荧光强度。

参考文献

Concept and connotation of oxidative stress in preeclampsia
Authors: Hayder M Al-Kuraishy, Ali I Al-Gareeb, Thabat J Al-Maiahy
Journal: Journal of Laboratory Physicians (2018): 276

Fluorescent real-time quantitative measurements of intracellular peroxynitrite generation and inhibition
Authors: Zhen Luo, Qin Zhao, Jixiang Liu, Jinfang Liao, Ruogu Peng, Yunting Xi, Zhenjun Diwu
Journal: Analytical biochemistry (2017): 44--48

Gene silencing of endothelial von Willebrand Factor attenuates angiotensin II-induced endothelin-1 expression in porcine aortic endothelial cells
Authors: Anar Dushpanova, Silvia Agostini, Enrica Ciofini, Manuela Cabiati, Valentina Casieri, Marco Matteucci, Silvia Del Ry, Aldo Clerico, Sergio Berti, Vincenzo Lionetti
Journal: Scientific Reports (2016)