Cyber Green 染料是美国AAT Bioquest生产的一种绿色荧光核酸染料，具有使染料可用于多种应用的功能，包括qPCR，熔解曲线分析，嗜热解旋酶依赖性扩增（tHDA）的实时监测，常规溶液DNA定量和结晶染料的激发和发射光谱与荧光素（FAM）或SYBR®GreenI的激发和发射光谱非常接近，使染料与配备488 nm氩激光器或任何可见光激发波长的仪器兼容。 Green 染料在热和水解方面都非常稳定，在日常处理过程中提供了便利。染料本身基本上是非荧光的，但在与dsDNA结合后变得高度荧光.Cyber Green 染料的独特性质使其在定量实时PCR（qPCR）应用中特别有用。与广泛使用的SYBR Green I相比，Cyber Green 对PCR的抑制作用较小，不太可能引起非特异性扩增。因此，Cyber Green 可以比SYBR Green我高得多的染料浓度使用，从而产生更强大的PCR信号。更重要的是，定量PCR允许的较高的CYber Green 浓度消除了“染料再分布”问题，这可能在PCR后DNA融解曲线分析期间与SYBR Green一起发生。

Cyber Green 20X水溶液专为qPCR使用而配制。可以使用现有的SYBR Green I或FAM光学设置在任何商业实时PCR循环仪上监测PCR反应。下面提供的qPCR协议用于使用常规非热启动Taq的PCR。使用热启动Taq可能需要在离子强度和pH方面对PCR缓冲液组成进行一些调整，以最好地利用Cyber Green 。例如，化学修饰的Taq，例如AmpliTaq Gold，可能更喜欢低低浓度的氯化钾或不含KCl的和较高的的Tris浓度（高达50mM的）。此外，经常加入水溶性溶剂如DMSO或甘油以稳定主混合物。可能需要根据所用的酶优化这些组分和pH值。

染色方案

建议将以下方案用于非热启动Taq酶。

1.设置PCR反应如下：

5μL不含Mg⁺²的10倍的聚合酶缓冲液

2.5μL50mMMgCl₂

每种5mM的2mM dNTP

2.5μL20XCyber Green

1-5单位的Taq DNA聚合酶

每种引物0.1-1μM（最终浓度）

双蒸水至终体积为50μL。

2.在热循环荧光计上进行实时PCR，并在退火或延伸步骤记录荧光信号。

注意：使用ABI序列检测系统时，请确保在WELL INSPECTOR选项卡下为被动参考选择NONE。

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