我们的Cell Meter 活细胞半胱天冬酶活性检测试剂盒基于半胱天冬酶的荧光抑制剂。这些抑制剂具有细胞渗透性和非细胞毒性。一旦进入细胞，半胱天冬酶抑制剂与活性半胱天冬酶共价结合。胱天蛋白酶3/7的激活对于细胞凋亡的起始是重要的。已经证明胱天蛋白酶3/7对肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）具有底物选择性。该试剂盒使用TF3-DEVD-FMK作为半胱天冬酶3/7活性的荧光指示剂。TF3-DEVD-FMK在凋亡细胞中不可逆地结合活化的胱天蛋白酶3/7。一旦与胱天蛋白酶3/7结合，荧光试剂保留在细胞内。结合抑制caspase 3/7，但不会阻止细胞凋亡的进行。

有多种参数可用于检测细胞凋亡。这种Cell Meter 活细胞半胱天冬酶3/7活性测定试剂盒旨在通过测量活细胞中胱天蛋白酶3/7的活化来检测细胞凋亡。它用于定量凋亡细胞中活化的caspase 3/7活性，或用于筛选caspase 3/7抑制剂。TF3-DEVD-FMK，红色标记试剂，允许通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪直接检测凋亡细胞中活化的半胱天冬酶3/7。该试剂盒为所有必需组分提供优化的分析方案。

分离细胞的检测方案

概述

用测试化合物制备细胞，密度为5×105至2×106个细胞/ mL

将TF3-DEVD-FMK以1：150的比例加入细胞溶液中

在室温下孵育1小时

沉淀细胞，用缓冲液或生长培养基洗涤并重悬细胞

在Ex / Em = 550 / 595nm处分析细胞

注：使用前将所有部件在室温下解冻。

操作方法

1.根据您的特异性诱导方案，将细胞培养至最适于细胞凋亡诱导的密度，但不超过2 x 106个细胞/ mL。同时，对于每种标记条件，以与诱导群体相同的密度培养非诱导的阴性对照细胞群。以下是一些诱导悬浮培养细胞凋亡的例子：

1）用2μg/ ml喜树碱处理Jurkat细胞3小时。

2）用1μM星形孢菌素处理Jurkat细胞3小时。

3）用4μg/ ml喜树碱处理HL-60细胞4小时。

4）用1μM星形孢菌素处理HL-60细胞4小时。

注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定诱导细胞凋亡的最佳细胞密度。

2.通过向TF3-DEVD-FMK（组分A）的小瓶中加入50μLDMSO制备150X TF3-DEVD-FMK DMSO储备溶液。 将150×TF3-DEVD-FMK以1：150的比例加入细胞溶液中，并将细胞在37℃，5％CO2培养箱中孵育1小时。

注1：对于TF3-DEVD-FMK标记，细胞可以浓缩至~5×10 6个细胞/ mL。 未使用的150X TF3-DEVD-FMK DMSO储备溶液应分为单次使用的等分试样并储存在-20°C。

注2：对于粘附细胞，用0.5mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在用TF3-DEVD-FMK孵育之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。

注3：适当的孵育时间取决于所用的细胞类型和细胞浓度。 优化每个实验的孵育时间。

3.将细胞以约200g旋转5分钟，并用1mL洗涤缓冲液（组分B）洗涤细胞两次。 将细胞重悬于所需量的洗涤缓冲液中。

注1：TF3-DEVD-FMK是荧光的，因此清除任何未结合的试剂以消除背景非常重要。

注2：对于分离的细胞，应将细胞浓度调节至每个微量滴定板孔中2-5×10 5个细胞/100μL等分试样，用于步骤5。

4.如果需要，用DNA染色标记细胞（例如用于死细胞的Nuclear Green DCS1，或用于细胞核染色的整个群体的Hoechst）。

5.通过荧光显微镜，流式细胞仪或荧光酶标仪在Ex / Em = 550/595 nm处检测荧光强度（对于Nuclear Green DCS1，Ex / Em = 490/525 nm，对于Hoechst染料，Ex / Em = 350/461 nm）

5.1对于流式细胞仪，使用Ex / Em = 550/595 nm（用于Nuclear Green DCS1染色的FL1通道）的通道监测荧光强度。

5.2用于荧光显微镜和荧光酶标仪。 将100μL细胞悬浮液置于96孔黑色微量滴定板的每个孔中。

注意：如果需要平衡细胞浓度，调整诱导细胞的悬浮体积以接近非诱导细胞群的细胞密度。 如果您的细胞治疗不会导致受刺激细胞群数量的显着损失，则此调整步骤是可选的。

5.3使用TRITC通道（用于Nuclear Green DCS1染色的FITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）在荧光显微镜下观察细胞。

5.4使用荧光酶标仪，使用Ex / Em = 550/595 nm（在570 nm处截止）底部读取模式监测荧光强度。

参考文献

An inner activation gate controls TMEM16F phospholipid scrambling
Authors: Trieu Le, Zhiguang Jia, Son C Le, Yang Zhang, Jianhan Chen, Huanghe Yang
Journal: Nature communications (2019): 1846

Drosophila Subdued is a moonlighting transmembrane protein 16 (TMEM16) that transports ions and phospholipids
Authors: Trieu Le, Son C Le, Huanghe Yang
Journal: Journal of Biological Chemistry (2019): jbc--AC118

Helicobacter pylori Secreted Protein HP1286 Triggers Apoptosis in Macrophages via TNF-Independent and ERK MAPK-Dependent Pathways
Authors: Raquel Tavares, Sushil Kumar Pathak
Journal: Frontiers in Cellular and Infection Microbiology (2017): 58

Death receptor 3 mediates necroptotic cell death
Authors: Sebastian Bittner, Gertrud Knoll, Martin Ehrenschwender
Journal: Cellular and Molecular Life Sciences (2016): 1--12

Helicobacter pylori protein JHP0290 exhibits proliferative and anti-apoptotic effects in gastric epithelial cells
Authors: Raquel Tavares, Sushil Kumar Pathak
Journal: PloS one (2015): e0124407