OxiVision Green 过氧化氢（H₂O₂）检测探针是美国AAT Bioquest生产的用于检测过氧化氢的荧光探针 ，尽管H₂O₂对人类健康和疾病具有重要意义，但由于缺乏可用于活细胞的敏感和特异性H₂O₂检测探针，其产生，积累，运输和功能的分子机制尚未充分了解。目前可用的H₂O₂响应探针的局限性包括来自其他ROS的干扰背景荧光，对外部活化酶的需要，缺乏水溶性或相容性，和/或紫外区域中的激发谱。OxiVision Green 过氧化氢探针无荧光，在可见光区域无吸收。加入H₂O₂会引起迅速的荧光增加，伴随着可见波长吸收带的增长。由于其二元吸收/发射响应，该探针具有大的动态范围。OxiVision Green 过氧化氢探针的荧光响应是H₂O₂选择性的。与相似的ROS（如O^2-，NO或-OCl）相比，OxiVision Green 过氧化氢探针对H₂O₂的选择性> 100倍。

操作步骤

1.准备OxiVision Green 过氧化氢：

1.1在高质量无水DMSO中制备2至5 mM OxiVision Green 过氧化氢储备液。应及时使用原液; 任何剩余的溶液应等分并冷冻于-20℃.

注意：避免反复冻融循环。

1.2准备2X OxiVision Green 过氧化氢工作溶液：在实验当天，将OxiVision Green 过氧化氢固体溶解在DMSO中，或将等份的原液溶解至室温。在20 mM Hepes缓冲液或您选择的缓冲液（pH 7）中制备浓度范围为2至20μM的2X工作溶液。建议使用最终浓度为5μM的OxiVision Green 过氧化氢测量溶液中H ₂O ₂浓度。

2.在上清液中运行H₂ O ₂测定：

2.1将50μL的2X OxiVision Green 过氧化氢工作溶液（来自步骤1.2）添加到H ₂ O ₂标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总 H ₂ O ₂测定体积为  100μL /好。

注意：对于384孔板中，添加样品的25μL和25μL 2X OxiVision绿色 过氧化氢工作液到每个孔中。

2.2在室温下孵育反应15至60分钟，避光。

2.3用Ex / Em = 490 / 525nm 的荧光板读数器监测荧光增加。

2.4空白孔中的荧光（仅含测定缓冲液）用作对照，并从具有H ₂ O ₂反应的那些孔的值中减去。

3.在活细胞中运行H₂ O ₂测定：

OxiVision Green 过氧化氢可被动加载到活细胞中，并报告细胞内H ₂ O ₂浓度的微摩尔变化。以下是建议的显微镜成像方案，可根据您的具体研究需要进行修改。

3.1所述的OxiVision绿色过氧化氢的工作溶液应该作为步骤1.2来制备。

3.2根据需要处理细胞。

3.3用 OxiVision Green 过氧化氢工作溶液孵育细胞5到60分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞两次。

3.4使用具有底部读取模式的荧光酶标仪检测Ex / Em = 490 / 525nm 处的荧光。或者使用FITC通道通过荧光显微镜检查荧光变化。

参考文献

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