PhosphoWorks 比色法MESG磷酸盐检测试剂盒 *UV吸收*是美国AAT Bioquest生产的用于检测ADP的试剂盒 ，ADP参与许多生物反应，例如蛋白激酶。 我们的ADP分析试剂盒可通过监测ADP的形成来普遍用于分析蛋白激酶反应，而ADP的形成与酶磷酸转移酶的活性成正比，并通过荧光法进行测量。 该试剂盒提供了一种快速，简单且均一的测定ADP形成或消耗的测定方法。 该测定是连续的，并且可以容易地适于自动化。 该套件很方便，需要最少的动手时间。 由于蛋白激酶与诸如癌症和其他增生性疾病，炎性疾病，代谢紊乱和神经系统疾病等疾病的广泛相关性，因此参与药物开发的研究人员对蛋白激酶很感兴趣。 大多数商业化的蛋白激酶检测试剂盒都是基于对磷酸肽形成或ATP缺失的监测。 我们的ADP检测试剂盒比大多数商业激酶检测试剂盒对蛋白质激酶的检测更稳定。

样品实验方案

简要概述

1.运行激酶反应（20 μL）
2.添加ADP传感器缓冲液（20 μL）
3.添加ADP传感器（10 μL）
4.在室温下孵育15分钟-1小时
5.监控荧光强度

溶液制备 

1.标准溶液

磷酸盐标准
向950μL去离子水或酶反应缓冲液中添加50μL1 mM KH2PO4（组分D），得到50μM磷酸盐标准溶液（PS7）。 取50μM磷酸盐标准溶液，并进行1：2连续稀释，以用去离子水或酶反应缓冲液连续稀释磷酸盐标准液（PS6-PS1）。

2.工作溶液

2.1将500 μL ddH2O加入小瓶MESG底物（组分B）。 涡旋混合均匀，得到MESG底物溶液。 注意：250 μl足够一块板。

2.2向小瓶嘌呤核苷磷酸化酶（PNP；组分C）中加入100 μL ddH2O。 涡旋混合均匀，得到嘌呤核苷磷酸化酶溶液。

2.3将全部体积的MESG底物溶液和嘌呤核苷磷酸化酶溶液添加到分析缓冲液（组分A）的瓶子中，并充分混合以得到工作溶液。 将工作溶液放在冰上。 注意：此工作溶液在冰上至少可稳定4小时。 不建议将工作溶液冷冻进行其他测定。 为了获得理想的结果，需要紫外线透明的板或比色皿。 由于该测定法对Pi的敏感性很高，因此使用无Pi的实验室器具极为重要。

样品示例及操作

表1.黑色96孔微孔板中ADP标准品和测试样品的布局。 SD = ADP标准（SD1-SD7，0.05至30 uM）; BL =空白对照； TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成。

1.根据表1和表2提供的布局，准备磷酸盐标准品（PS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，每孔使用25 μL试剂代替50 μL。

2.将50 μL工作溶液添加到磷酸盐标准液，空白对照和测试样品的每个孔中，以使总测定体积为100 μL /孔。 彻底混合试剂。 对于384孔板，请向每个孔中添加25 μL工作溶液，总体积为50 μL /孔。

3.在室温下孵育30分钟。

4.用酶标仪或分光光度计在360 nm处监测吸光度。 注意：对于需要总体积大于100 μL的比色杯分析，在测量吸收之前，应按比例将样品和分析试剂的体积相乘。

参考文献

Sacrificial crystal templating of hyaluronic acid-based hydrogels
Authors: Richelle C Thomas, Paul E Chung, Shan P Modi, John G Hardy, Christine E Schmidt
Journal: European Polymer Journal (2016)

Osteogenic cell cultures cannot utilize exogenous sources of synthetic polyphosphate for mineralization
Authors: Marianne B Ariganello, Sidney Omelon, Fabio Variola, Rima M Wazen, Pierre Moffatt, Antonio Nanci
Journal: Journal of cellular biochemistry (2014): 2089--2102