Bucculite FdU 细胞增殖荧光成像试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测细胞活力的试剂盒 ，检测细胞增殖是评估细胞活力、细胞周期和基因毒性的最可靠方法之一。检测细胞增殖的一种基本方法是在细胞生长的 S 期期间在胸苷存在的情况下测量 DNA 合成。 Bucculite FdU 细胞增殖荧光成像试剂盒使用 FOL-FdU，一种胸苷类似物。 FOL-FdU 在 DNA 合成过程中被整合到细胞 DNA 中。固定细胞后，通过我们的 Buccutite 标记技术用 MTA-iFluor 488 标记掺入的 FOL-FdU。细胞中形成的 iFluor 488 标记 DNA 在 FITC 通道中可以被荧光仪器检测到。 Bucculite FdU 细胞增殖荧光成像试剂盒提供了一种替代抗 BrdU 抗体的检测和 EdU 点击化学检测的方法。它是一种环境友好的无铜检测方法，用于在单细胞水平上检测活性 DNA 合成。

样品实验方案

简要概述

1.准备细胞（对于96孔板为100 μL /孔，对于384孔板为25 μL /孔）

2.对于96孔板，以100 μL /孔添加2X FOL-FdU工作溶液

3.在37oC下孵育3小时

4.取出培养基，并在室温下用100μL冰冷的90％甲醇的PBS溶液固定细胞15分钟

5.除去固定液并用PBS洗涤3次

6.加入1X iFluor 488-MTA工作溶液（100 μL /孔）并在室温下染色30分钟。

7.除去每个孔中的工作溶液，并用1X洗涤缓冲液洗涤细胞3次。

8.加入100μL 1X洗涤缓冲液/孔，并用FITC滤光片组观察紫外荧光显微镜。

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。避免重复冻融循环。

1.1 FOL-FdU储备溶液（1000X）：
将500 μL DMSO（组分E）添加到FOL-FdU（组分A）中，制成1000X储备溶液。注意：此1000X浓度是使用具有最佳FOL-dU浓度的HeLa细胞开发的。生长培养基，细胞密度，细胞类型变化和其他因素可能会影响标记。我们建议测试一系列FOL-FdU浓度，以确定适合您的细胞类型和实验条件的最佳浓度。
1.2 iFluor 488-MTA储备溶液（400X）：
将50 μL DMSO（组分E）添加到iFluor 488-MTA（组分B）中，制成400 X iFluor 488-MTA储备溶液。

2.工作溶液

2.1 X FOL-FdU工作溶液

在完全培养基中将1000X FOL-FdU储备溶液稀释500倍，以制备2X FOL-FdU工作溶液。
2.2 X iFluor 488-MTA工作溶液

将2.5 μL 400X iFluor 488-MTA储备溶液添加到1mL染色缓冲液（组分C）中，以制备1X iFluor 488-MTA工作溶液。

2.3 X洗涤缓冲液

向9mL PBS中加入1mL 10X洗涤缓冲液（组分D），制成1X Washing Buffer。 

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操作步骤

1.准备细胞

1.1对于贴壁细胞：将细胞在生长培养基中以10,000至40,000个细胞/孔/ 100 μL（对于96孔板）过夜培养，以2,500至10,000个细胞/孔/ 20 μL（对于384孔板）过夜培养。

1.2对于非贴壁细胞：离心培养液中的细胞，并将细胞沉淀以1-2 X 106细胞/ ml（对于10个96孔板为10 mL）悬浮在培养液中。注意：应单独评估每个细胞系，以确定最佳细胞密度。

2.用FOL-FdU标记细胞

2.1将等体积的2X FOL-FdU工作溶液添加到含有要处理的细胞的培养基中，以在每个孔中获得1X FOL-FdU溶液。我们不建议更换所有培养基，因为这可能会影响细胞增殖速率。

2.2在最适合细胞类型的条件下孵育细胞3小时。FOL-FdU暴露于细胞的时间可以直接测量合成DNA的细胞。孵育时间取决于细胞生长速率。

3.细胞固定

3.1孵育后，移出培养基，并向每个孔中加入100μL冰冷的PBS中的90％甲醇（未提供，甲醇/ PBS，v / v为90/10），并在室温下孵育15分钟。

3.2除去固定缓冲液，并用PBS清洗每个孔中的细胞两次。

4.染色细胞

4.1在细胞板中加入100 μL /孔（96孔板）或50 μL /孔（384孔板）的1X iFluor™488-MTA工作溶液。在避光的条件下，将细胞与工作溶液在室温下孵育30分钟。

4.2除去每个孔中的工作溶液。

4.3用1X洗涤缓冲液洗涤细胞3次，洗涤后每孔加入100μL洗涤缓冲液。注意：如果需要Hoechst 33342染色剂，请在1X洗涤缓冲液中制成5-10 μg / ml Hoechst 33342溶液并染色30分钟。

4.4使用带有FITC滤光片组的荧光显微镜观察细胞中的荧光信号。