MycoLight 流式细胞计数活细菌检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测细菌的试剂盒 ，MycoLight流式细胞术活菌分析试剂盒提供了一种简便的方法，可根据细胞内酯酶活性评估细菌活力。 MycoLight™520是一种非荧光酯酶底物，可扩散到革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中。 通过细菌细胞内非特异性酯酶水解后，会产生绿色荧光产物，并在细菌内积累。 与常用的酯酶底物CFDA和CFDA-AM相比，该试剂盒可提供更明亮，更稳定的信号，具有更低的背景和更容易的染色方案。

样品实验方案

简要概述

1.准备100X染料储备溶液。
2.准备细菌样品。
3.将细菌样品与MycoLight 520在黑暗中于37°C孵育5-10分钟或在室温下孵育60分钟。
4.通过带有FITC通道的流式细胞仪分析样品。

溶液配制

1.储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1MycoLight 520储备液（100X）：
将100 μL DMSO（组分C）加入一小瓶MycoLight 520（组分A）中，制成100X储备液。

样品示例及操作

1.准备细菌样品，浓度范围为106到108个细胞/ ml。在适当的培养基中使细菌生长到对数后期。通过以10,000 x g离心10分钟除去培养基，然后将沉淀重新悬浮在测定缓冲液（组分B）中。注意：在波长= 600 nm（OD600）处测量细菌培养物的光密度，以确定细胞数。对于大肠杆菌培养，OD600 = 1.0等于8 x 108细胞/ ml。

2.根据需要用测试化合物处理细胞。通过以10,000 x g离心10分钟来去除处理液，然后将沉淀物重新悬浮在适量的测定缓冲液（组分B）中，以使处理后样品中的细菌浓度与活菌浓度相同。注意：开始治疗之前，请确定细菌培养物的浓度。注意：死细菌可以作为阴性对照，建议使用70％乙醇杀死细菌30分钟，然后煮沸60分钟。

3.活/死细菌混合物制备示例：混合7种不同比例的细菌悬液，如表1所示，每个样品的总体积为200 μL。

4.将2 μL 100X MycoLight 520储备液加到200 μL Assay Buffer中的细菌样品中。

5.充分混合并在黑暗中于37°C孵育5-10分钟，或在室温孵育60分钟，以获得最佳染色效果。

6.在使用流式细胞仪分析细胞之前，添加300 μL分析缓冲液（组分C）以增加体积。

7.用流式细胞仪通过FITC通道（488/530 nm）监测细菌的荧光。注意：要排除杂物，建议将流式细胞仪的阈值设置为以下值：FSC> 10,000，SSC> 5,000。注意：MycoLight 520的效率高度依赖菌株，因此应相应优化染色条件。

表1.混合以达到各种活/死比的活样本和死样本的示例体积

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