Cell Meter 钙检测免洗和免丙磺舒检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于检测葡萄糖 的试剂盒，Cell Meter 无洗涤和无丙磺舒钙测定试剂盒可实现均相荧光测定，用于检测细胞内钙动员，无需使用动力学读数模式。它可用于具有底部读取模式的荧光酶标仪，其没有内置液体分配器或动力学读数的能力。将Fluo-8E AM染料加入感兴趣的细胞后，无需洗涤步骤，可以通过液体分配器或手动移液器简单地添加钙通量激动剂，然后通过荧光读数器在Ex / Em = 490 /读取板525纳米。 Fluo-8E AM可通过扩散被动地穿过细胞膜。一旦进入细胞内，Fluo-8E AM的亲脂性阻断基团被酯酶切割，产生带负电荷的荧光染料，留在细胞内。它的荧光大大增强，并且在与钙结合后持久。当用激动剂刺激表达目的GPCR的细胞时，该受体发出细胞内钙的释放信号，这显着增加了Fluo-8E 的荧光。其高灵敏度，> 100倍荧光增强和持久荧光信号的特性使Fluo-8E 成为荧光酶标仪上细胞钙测量的理想指标，不具备流体转移和动态读数模式的能力。 Cell Meter 无洗涤和无丙磺舒的终点钙测定试剂盒可以96孔或384孔板进行实验。

样品实验方案

简要概述

1.在生长培养基中准备细胞
2.添加Fluo-8E AM染料加载溶液（对于96孔板为100 μL /孔，对于384孔板为25 μL /孔）
3.在37°C孵育60分钟
4.加入50 μL钙通量刺激剂
5.监测Ex / Em = 490/525 nm的荧光强度

溶液制备 

1.储备溶液

所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。 避免重复冻融循环。
1.1 Fluo-8E AM储备方案：
在Fluo-8E AM（组分A）小瓶中加入10 μL DMSO，并充分混合。 注意：10 μL Fluo-8E AM储备溶液足以进行50次测定（96孔板的一半）。 注意：如果试管密封严密，可以将未使用的Fluo-8E AM储备溶液分装并在<-20℃下保存1个月以上。 避光并避免重复的冻融循环。

1.2 分析缓冲液（1X）：
将9 mL的HHBS（组分C）加入10XPluronic®F127 Plus（1 mL，组分B）中，并充分混合。 注意：10毫升测定缓冲液（1X）足以用于一块板。 分装并在<-20°C下存储未使用的1X分析缓冲液。 避光并避免重复的冻融循环。

2.工作溶液

Fluo-8E AM染料：
将10 μL Fluo-8E AM储备溶液添加到5 mL的测定缓冲液（1X）中，并充分混合。 注意：此工作溶液在室温下至少可稳定2小时。

样品操作及实验分析

1.将100 μL /孔（96孔板）或25 μL /孔（384孔板）的Fluo-8E™AM染料加载溶液添加到细胞板中。 不要从细胞板上除去生长培养基。

2.在细胞培养箱中将染料加载板孵育45-60分钟。
 
3.用HHBS或所需的缓冲液准备钙刺激剂溶液（5X）。

4.加入50个准备好的刺激物，并通过底部读取模式通过监测Ex / Em = 490/525 nm处的荧光强度立即运行钙通量测定。 注意：为获得最佳结果，重要的是在添加激动剂后1分钟内进行测定。 确保激动剂添加到实际读数开始之间的时间对于所有样品保持恒定也很重要。

参考文献

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