Sulfo-SMCC 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐是美国AAT Bioquest生产的荧光染料 ，Sulfo-SMCC是SMCC的水溶性形式。它含有胺反应性磺基琥珀酰亚胺酯（SSE）和巯基反应性马来酰亚胺基团。NHS酯在pH 7-9下与伯胺反应形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺与pH6.5-7.5的巯基反应形成稳定的硫醚键。SMCC的SSE组与载体蛋白上的赖氨酸残基反应，将它们转化为反应性马来酰亚胺。Sulfo-SMCC是一种广泛用于产生稳定的马来酰亚胺激活的载体蛋白的试剂，其可以自发地与巯基反应。或者，可将这些相对稳定的马来酰亚胺活化的中间体冻干并储存，以便随后与半抗原缀合。

样品实验方案

1.制备含胺蛋白质的缀合缓冲液，蛋白质-NH ₂ （缓冲液A）：磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）或pH值为7.2至8.0的其他无胺缓冲液可用于此。

注意：避免在缀合过程中含有伯胺（如Tris或甘氨酸）和巯基的缓冲液，因为它们会与预期的反应竞争。如有必要，将样品透析或脱盐至适当的缓冲液如PBS中。

2.制备含巯基蛋白质的缀合缓冲液，蛋白质-SH（缓冲液B）：pH为6.5-7.5的不含巯基的缓冲液可用于此。

注1：在缀合过程中避免使用含有巯基的缓冲液，因为它们会与预期的反应竞争。如有必要，将样品透析或脱盐至适当的缓冲液如PBS中。

注2：加入1-5mM EDTA有助于螯合二价金属，从而减少含巯基蛋白质中的二硫化物形成。

3.准备脱盐柱，将改性蛋白与过量交联剂和反应副产物分离。

4.在其缀合缓冲液A和缓冲液B中制备含胺蛋白质（蛋白质-NH₂）和含巯基蛋白质（蛋白质-SH）溶液。

5.制备蛋白质1-NH ₂ -SMCC（或SMCC Plus）缀合物：将适量的SMCC（或SMCC Plus）加入到缓冲液A中的含胺蛋白质溶液中。蛋白质-NH ₂的浓度 决定SMCC（或SMCC Plus）摩尔过量使用。SMCC（或SMCC Plus）摩尔过量的建议体积如下，但 比例必须使用目标蛋白质通过实验确定：

• 蛋白质样品<1 mg / mL使用40-80倍摩尔过量。
• 1-4 mg / mL的蛋白质样品使用20倍摩尔过量。
• 5-10 mg / mL的蛋白质样品使用5至10倍摩尔过量。

6.将上述反应混合物在室温下孵育30-60分钟或在4℃孵育2-4小时。

注1：为了在完成前停止缀合反应，加入含有还原半胱氨酸的缓冲液，其浓度比Protein-SH的巯基浓度高几倍。

注2：可以通过电泳分离和随后的蛋白质染色来估计缀合效率。

7.使用用共轭缓冲液A平衡的脱盐柱除去多余的SMCC（或SMCC Plus）。

8.将含硫醇（蛋白-SH）和脱盐的含胺蛋白（蛋白-NH ₂）SMCC（或SMCC Plus）缀合物混合并混合，摩尔比对应于最终缀合物所需的摩尔比，并与亲属一致两种蛋白质上存在的巯基和活化胺的数量。

注意：与马来酰亚胺部分反应的分子必须具有游离（还原的）巯基。对于蛋白质，在室温下使用5mM TCEP还原二硫键30分钟，然后通过合适的脱盐柱两次。请注意，蛋白质（例如抗体）可能会通过完全还原其二硫键而失活。可以用2-巯基乙胺·HCl（2-MEA）实现IgG中铰链区二硫键的选择性还原。可以使用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）或2-亚氨基硫杂环戊烷·盐酸盐（Traut's Reagent）将巯基化合物添加到分子中，后者可以修饰伯胺。

参考文献

N-glycan targeted gene delivery to the dendritic cell SIGN receptor
Authors: Kevin Anderson, Christian Fernandez, Kevin G Rice
Journal: Bioconjugate chemistry (2010): 1479--1485