DCFH-DA [2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯]广泛用于监测细胞氧化还原的过程。2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（也称为2'，7'二氯荧光素二乙酸酯）被细胞酯酶水解成2'，7'-二氯二氢荧光素（也称为2'，7'-二氯荧光素），然后被氧化成2' ，7'-二氯荧光素主要由H₂O₂。 2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯可能在细胞内氧化剂应激期间对广泛的氧化反应具有反应性。 

用于染色细胞的样品方案

以下过程提供了一般准则，实际情况应根据您的特定应用进行修改。

1.制备1-10mM DMSO储备溶液。 应将未使用的DMSO储备溶液等分到单次使用的小瓶中并储存在-20℃，避光。

2.在生理缓冲液（如PBS，HBSS，HEPES）中使染料的工作浓度为1-10μM。必须根据经验确定最佳工作浓度。

3.从生长培养基中取出细胞，将染料工作溶液（来自步骤2）加入细胞中，并在室温或37℃下孵育细胞5至60分钟。

4.去除染料工作溶液; 用预热的HBSS洗涤，加入预热的HBSS或生长培养基，在最佳温度下孵育。 最佳孵育时间可能相差较大，因为一些细胞类型通常表现出低水平的酯酶活性。

5.在将细胞暴露于实验诱导物之前，确定加载细胞样品的基线荧光强度。

6.阴性对照应评估如下：

6.1检查未染色的细胞在绿色发射范围内的自发荧光。

6.2对于流式细胞术，确定染料加载和处理后细胞的正向和侧向散射不变。细胞尺寸的变化可能与处理或毒性反应引起的起泡或收缩有关。

6.3检测有没有诱导物的染料和缓冲液/培养基的无细胞混合物的荧光。在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，荧光随时间的逐渐增加可能与自发水解，大气氧化或光诱导有关。

6.4检查已经保存在生长培养基或简单缓冲液中的未处理（对照）负载细胞的荧光。在染料加载孵育后，健康细胞应表现出低水平的荧光，在实验期间相对稳定; 然而，可以观察到荧光逐渐增加（由于自动氧化）或减少（由于细胞中的染料损失或光漂白）。 在没有任何刺激或诱导的情况下，健康的未经处理的细胞中的荧光突发可以指示细胞死亡或一些其他氧化事件的进展。

7.可以用H₂O₂或叔丁基过氧化氢（TBHP）刺激阳性对照至终浓度~100μM（基于细胞的敏感性和反应增加或减少剂量）。

参考文献

Kinetic analysis of fluorescein and dihydrofluorescein effluxes in tumour cells expressing the multidrug resistance protein, MRP1
Authors: Saengkhae C, Loetchutinat C, Garnier-Suillerot A.
Journal: Biochem Pharmacol (2003): 969

Mitochondrial localization of reactive oxygen species by dihydrofluorescein probes
Authors: Diaz G, Liu S, Isola R, Diana A, Falchi AM.
Journal: Histochem Cell Biol (2003): 319

Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123
Authors: Hempel SL, Buettner GR, O'Malley YQ, Wessels DA, Flaherty DM.
Journal: Free Radic Biol Med (1999): 146

A rapid diagnostic test for the viability of early cattle and rabbit embryos using diacetyl-fluorescin
Authors: Schilling E, Dopke HH.
Journal: Naturwissenschaften (1978): 658

Determination of fluorescin sodium in ophthalmic solutions
Authors: Robertson EJ, Patel JA.
Journal: Am J Hosp Pharm (1968): 598

[Experimental research on insulin antibodies. II. Immunochemical characterization of guinea pig anti-ox insulin serum conjugated with fluorescin isothiocyanate.]
Authors: Mancini AM, Zampa GA, Costanzi G.
Journal: Boll Soc Ital Biol Sper (1961): 1230

[Experimental research on insulin antibodies. III. Immunohistology of the endocrine pancreas with guinea pig anti-bovine insulin serum, conjugated with fluorescin isothiocyanate.]
Authors: Costanzi G, Mancini UM, Zampa GA.
Journal: Boll Soc Ital Biol Sper (1961): 1233

Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin
Authors: King EO, Ward MK, Raney DE.
Journal: J Lab Clin Med (1954): 301

Influence of the concentration of iron on the production of fluorescin by Pseudomonas aeruginosa
Authors: Totter JR, Moseley FT.
Journal: J Bacteriol (1953): 45

Transfer of fluorescin from Ps. pyocyanea to colonies of other bacteria
Authors: Hurst L, Lowbury EJ.
Journal: J Clin Pathol (1952): 359