FDP [荧光素二磷酸酯四铵盐]是美国AAT Bioquest生产的荧光素 ，该产品在与磷酸酶相互作用后，无色和非荧光FDP被水解成高荧光荧光素，其表现出优异的光谱特性，与配备有氩激光激发的大多数荧光仪器的最佳检测相匹配。或者，FDP也可用于检测发色模式中的磷酸酶，因为酶产物（荧光素）表现出很大的消光系数（接近100,000cm-1mol-1）。在一些文献中，FDP被认为是最敏感的荧光磷酸酶底物之一。FDP已广泛用于各种ELISA测定。此外，它还用于检测酪氨酸磷酸酶。FDP是热不稳定的，需要特别注意保存固体样品和储备溶液。

Mup是用于磷酸酶的荧光底物。它广泛用于检测溶液中的磷酸酶。然而，这种磷酸酶底物不适合活细胞或连续测定，因为MU（4-甲基伞形酮）是酶产物，其仅在pH值> 10时发展出最大荧光。因此，也难以使用MUP检测具有酸性最佳pH范围的磷酸酶，例如酸性磷酸酶。

AAT Bioquest提供的CF-MUP Plus，用于解决与MUP基质相关的pH限制问题。CF-MU在pH 5.0以上表现出最大荧光，因此CF-MUP底物可以很好地用于连续磷酸酶测定。它还可以用于酸性pH的测定，例如酸性磷酸酶和一些蛋白磷酸酶。

衍生自红色荧光二甲基吖啶酮（Sun Red）的磷酸酶底物仅含有单个水解敏感部分，从而避免了基于荧光素底物的双相动力学。磷酸酶催化的太阳红磷酸盐（SRP）的水解产生可以用633nm激光激发并且发射~660nm的太阳红荧光团。虽然Sun Red很容易在633 nm处激发，红色发射约为660 nm，但SRP在633 nm处的吸收非常小，没有红色发射，使SRP成为最敏感的NIR磷酸酶传感器之一。请不要使用DMSO制备储备溶液，因为它会显著增加分析背景。

磷酸盐底物的测定方案

概述

在Tris缓冲液（50μL）中制备10-50μM磷酸盐

添加磷酸酶标准品和/或测试样品（50μL）

在室温或37℃孵育30至120分钟监测荧光强度

注意：以下是溶液中磷酸酶测定的推荐方案。 该说明仅提供指导，应根据具体需要进行修改。

1.准备工作解决方案：

1.1在升值溶剂中制备2至10 mM的储备溶液（见说明书中的表）。任何未使用的溶液需要等分并在<-20℃冷冻。

注意1：不要使用DMSO，ETOH或METH制备SunRed™磷酸盐（目录号11629）的原液，因为它可以显著提高分析背景。

注意2：避免反复冻融循环，避免光照。

1.2制备2X磷酸盐工作溶液：在实验当天，将底物溶解在升值溶剂中或在室温下解冻等份的储备溶液（来自步骤1.1）。在100 mM Tris缓冲液或您选择的缓冲液（pH 8至9）（非磷酸盐缓冲液）中制备10至50μM的2X工作溶液。

2.在上清液中进行磷酸酶测定：

2.1将50μL2X磷酸盐工作溶液（来自步骤1.2）加入磷酸酶标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总磷酸酶测定体积为100μL/孔。

注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μL2X磷酸盐工作溶液。

2.2在所需温度下孵育反应30至120分钟，避光。

2.3用荧光板读数器检测适当滤光片组（见说明书中的表）的荧光增加。

2.4空白孔中的荧光（仅用测定缓冲液）用作对照，并从具有磷酸酶反应的那些孔的值中减去。

参考文献

Fluorescence quantification of intracellular materials at the single-cell level by an integrated dual-well array microfluidic device
Authors: Chenyu Wang, Lufeng Ren, Wenwen Liu, Qingquan Wei, Manqing Tan, Yude Yu
Journal: Analyst (2019)

Multifunctional and Programmable Modulated Interface Reactions on Proteinosomes
Authors: Pei Zhou, Shuang Wu, Xiaoman Liu, Guangyu Wu, Mohammad Hegazy, Xin Huang
Journal: ACS Applied Materials & Interfaces (2018)