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蛋白A检测ELISA试剂盒说明书
96次检测
货号Bk301
保存：2-8℃
有效期：6个月
只供科研和生产用，不应用于 或诊断，使用前请认真完整地阅读此说明书！
适用范围
此蛋白A检测ELISA试剂盒用来定量检测重组耐碱性等非天然的蛋白A，只能用于科研和生产，不能应用于人或动物疾病的诊断 。本试剂盒提供一个样品的酸化处理方法，把蛋白A从IgG产品中分离出来，在人源化单抗浓度高达2mg/mL的情况下，蛋白A的检测限低至78pg/mL以下。
检测原理
此试剂盒采用标记生物素系统的双抗夹心的技术方法。酶标板预包被蛋白A的特异性单克隆抗体，含有蛋白A的样品使用样品稀释液进行稀释，然后酸化液混合使蛋白A从抗体产品中的分离出来，样品和预包被在酶标板上的蛋白A捕获抗体反应。再加入生物素标记的检测抗体反应形成夹心三明治复合物。然后洗涤去除没有参与反应的物质，加入亲和素标记的HRP，短暂孵育后，进行TMB显色，然后加入终止液终止显色反应，在450nm处检测吸光值，OD值和样品含量成正比关系。
需要用到但试剂盒没有提供的东西
1. 10-1000μL的移液器，单道和多道
2. 100mL和1000mL的烧杯
3. 去离子水
4. 各种型号离心管
5. 酶标仪（测450nm）
6. 数据处理分析软件
试剂盒组成成分：
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Component |
Product # |
Storage |
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1. Protein A Standard（proteinA蛋白标准品） Recombinant Alkali-tolerant Protein A in a protein matrix with preservative, 50μg/mL, 1x0.1mL |
Bk031 |
2-8°C |
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2. Biotinylated Antibody（生物素标记的抗体） Biotinylated anti-protein A monoclonal antibody in a protein matrix with preservative, 1x13mL |
Bk016 |
2-8℃ |
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3.Sample Diluent （样品稀释液） Tris buffered saline with a protein matrix and preservative, 1x30mL |
Bk017 |
2-8℃ |
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4. Denaturing Buffer （酸化缓冲液） Citrate buffer with detergent and preservative, 1x20mL |
Bk018 |
2-8℃ |
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5. 10x Assay Buffer （10x）洗涤缓冲液 phosphate buffer with preservative, 1x30mL |
Bk004 |
2-8℃ |
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6. Streptavidin labeled HRP 亲和素标记的HRP Streptavidin labeled HRP in a protein matrix with preservative, 1x13mL |
Bk019 |
2-8℃ |
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7. TMB Substrate （TMB显色液） 3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine, 1x13mL |
Bk007 |
2-8℃ |
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8. Stop Solution （终止液） 2M sulphuric acid , 1x13mL |
Bk008 |
2-8℃ |
|
9. Monoclonal anti-Protein A Coated plate of 96 wells （包被proteinA抗体的96孔酶标板） 12x8 well strips in a bag with desiccant |
Bk032 |
2-8℃ |
试剂准备：
1. 本试剂盒使用前请放置室温（20-25度）
2. 洗涤液配制：30mL洗涤液（10x）中加入270mL去离子水，混匀配成300mL工作洗涤液。如果里面有结晶，请溶解混匀再使用
3. 其他试剂不用稀释直接进行使用
样品处理过程：
1. 样品如果需要稀释，采用试剂盒内的样品稀释液进行稀释，可以在96孔板或EP管中进行。
2. 确保每个含有样品的孔（管）的体积都是100μL。
3. 另外加入100μL的标准品和质控品到孔里。
4. 每个孔再加入50μL酸化液，吹打混匀，室温孵育10min（使样品中proteinA和抗体酸化分离）。
注意事项：
1. 本试剂盒只可用于科研生产，不可用于体外诊断。
2. 终止液是2M的硫酸，避免接触到眼睛、皮肤和衣物。除此之外，本试剂盒中的试剂不会对人体有任何伤害。
3. 高或低的pH值，洗涤剂，尿素，高盐浓度和有机试剂都是ELISA方法的影响因素，pH的影响很大，样品PH值应控制在7.0-7.4。
4. 如果您在使用过程中有任何问题，请联系本公司技术部门。
试剂盒操作步骤：
1. 标准品稀释：
8个离心管标记1#-8#，取990μL样品稀释液加入到1#和2#管中，取500μL样品稀释液加入到3#-8#管中。再取10μL样品标准品加入到1#管中，涡旋混匀后取10μL再加入到2#管中涡旋混匀。然后取2#管500μL液体加入到3#管中涡旋混匀，再取3#管500μL液体至4#管中涡旋混匀，如此直至8#管。
稀释完全之后 ，2#-8#离心管中protein A标准品的浓度分别为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078ng/mL。另外标记一管为0ng/mL，加入样品稀释液。
标准品和样品准备好之后就进入样品处理程序。
2. 在包被有protein A抗体的酶标板中加入100μL/孔的生物素标记的结合抗体。
3. 再加入25μL酸化处理好的标准品、样品、质控品和空白到合适的孔里，室温孵育1h。
4. 甩干，洗涤4次之后，加入100μL/孔的亲和素标记HRP，室温孵育10min。
5. 甩干，洗涤4次之后，加入100μL/孔的TMB显色液，显色10min，加入100μL/孔终止液，然后在450nm处检测吸光值。
数据处理和结果分析：
利用软件（如Curve Expert或ELISA Calc）通过标准品浓度梯度来建立检测标准曲线，把OD值和标准品浓度的对应关系用4参数逻辑拟合或三次多项式线性拟合成标准曲线，然后把检测样品的OD值带入相应曲线方程计算出对应的样品浓度。
典型的标准品检测数据和曲线拟合：
|
标准品浓度（ng/mL） |
平行孔OD |
平均值 |
除零OD值 |
|
|
5 |
2.085 |
2.096 |
2.0905 |
2.063 |
|
2.5 |
1.294 |
1.272 |
1.283 |
1.2555 |
|
1.25 |
0.737 |
0.743 |
0.74 |
0.7125 |
|
0.625 |
0.43 |
0.436 |
0.433 |
0.4055 |
|
0.3125 |
0.227 |
0.214 |
0.2205 |
0.193 |
|
0.156 |
0.142 |
0.128 |
0.135 |
0.1075 |
|
0.078 |
0.088 |
0.079 |
0.0835 |
0.056 |
|
0 |
0.027 |
0.028 |
0.0275 |
- |
分析方法指标：
1、精密度：在样品浓度大于0.3ng/mL的时候，检测变异系数小于10%；样品浓度小于0.3ng/mL的时候，检测变异系数略大于10%。
2、建议检测具体样品的时候，采用添加质控品的方法来考察样品基质效应对检测结果的影响。
3、本试剂盒的灵敏度为0.05ng/mL。
4、勾状效应：本试剂盒是双抗夹心一步法，产生勾状效应的浓度为10μg/mL。
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